qPCR檢測
實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種研究基因表達量的重要方法，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。
qPCR重要參數(shù)
? 擴增曲線
qPCR反應(yīng)開始時，熒光信號不穩(wěn)定，呈現(xiàn)波動狀態(tài)，隨后信號會趨于穩(wěn)定并且呈現(xiàn)指數(shù)性增長，到達一定循環(huán)數(shù)之后，熒光信號強度不再增加，持續(xù)穩(wěn)定。
擴增曲線展現(xiàn)出來為一條S型曲線，包括：基線期，指數(shù)擴增期，平臺期。反應(yīng)完成后，qPCR儀會以基線期熒光信號標準偏差的10倍生成一條閾值線，閾值線與擴增曲線產(chǎn)生交點，交點對應(yīng)的橫坐標代表Ct值，Ct值的含義代表每一個反應(yīng)體系中熒光信號強度達到閾值時經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)，其本質(zhì)不難看出就是循環(huán)數(shù)，它是熒光定量中唯一用于后續(xù)計算的數(shù)值，是后續(xù)定量計算的基礎(chǔ)。
? 熔解曲線
熔解曲線是指隨著溫度升高，反映DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。擴增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線，熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個特征峰就可以將特異性產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開。
qPCR定量方法
定量方法包括相對定量和絕對定量，兩者的重要差異在于相對定量的結(jié)果是差異性的結(jié)果，涉及比較；而絕對定量的結(jié)果是一個具體數(shù)值，對于基因表達量而言是基因的拷貝數(shù)，不涉及任何比較。
? 相對定量
首先需要確定一個內(nèi)參基因，常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，其本質(zhì)作用是利用內(nèi)參基因的Ct值對目的基因的Ct值進行均一化處理。其次，相對定量需要確定參照物，參照物選擇不同，所得的定量結(jié)果可能完全相反，經(jīng)常選擇的參照物一般是對照組或未處理組。
? 絕對定量
首先需要建立Ct值和拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，即標準曲線，由標準品生成。標準品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴增效率完全相同。標曲是由不同梯度標準品生成，落在標曲上的梯度點最好有5個及以上，標準品和待測樣品同時反應(yīng)，將待測樣品檢測的Ct值代入標曲后即可換算出待測樣品中基因的拷貝數(shù)。
qPCR檢測方法
qPCR最常用的兩種檢測方法分別為SYBR Green染料法和TaqMan探針法。
? SYBR Green染料法
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green熒光染料，其特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的熒光染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
SYBR Green染料法需要注意引物的特異性，因為非特異擴增產(chǎn)物和引物二聚體均為dsDNA，所以該方法只能通過引物來保證特異性。
全式金推出的PerfectStart? Green qPCR SuperMix采用PerfectStart? Taq熱啟動酶，采用3種抗體封閉，有效地封閉了DNA聚合酶活性，阻止了低溫下的非特異性擴增。
● 產(chǎn)品特點
? 3種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率強，適用物種范圍廣。
? 雙陽離子緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，數(shù)據(jù)準確。
? 配有適用于不同機型的Universal Passive Reference Dye (調(diào)整PCR加樣誤差引起的管間差異)，數(shù)據(jù)準確。
● 3種抗體封閉原理圖
● 封閉效果
以不同濃度人gDNA為模板擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PerfectStart? Taq熱啟動酶的封閉效果。結(jié)果顯示，封閉后可顯著提高擴增靈敏度和特異性。
以小麥cDNA為模板，qPCR檢測PerfectStart? Taq熱啟動酶的封閉效果。結(jié)果顯示，封閉后可顯著提高擴增特異性。
● 擴增效率
以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA (10 ng-0.1 pg，10倍稀釋 ) 為模板進行qPCR擴增。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品擴增效率較高，可得到漂亮的擴增曲線和標準曲線。
● 無NTC擴增基因數(shù)量統(tǒng)計
使用TransGen與Company T的產(chǎn)品，擴增58個基因 (9個人的基因，7個小鼠的基因，17個水稻的基因，8個煙草的基因，4個擬南芥的基因，10個小麥的基因，3個玉米的基因)。無NTC擴增基因數(shù)統(tǒng)計。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品無NTC擴增基因數(shù)高于Company T，擴增效果更佳。
● 擴增靈敏度
以500 ng的人源RNA反轉(zhuǎn)錄(TransGen, AT311)后得到的cDNA為模板梯度稀釋，分別使用TransGen與Company T產(chǎn)品擴增β-actin (NTC無擴增 )。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品擴增靈敏度與Company T產(chǎn)品基本一致。
● 不同物種模板擴增
以不同物種的RNA反轉(zhuǎn)錄(TransGen, AT311)后得到的cDNA為模板分別使用TransGen與Company T的產(chǎn)品進行擴增(NTC無擴增)。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品擴增效果與Company T產(chǎn)品基本一致。
● 產(chǎn)品穩(wěn)定性
不同溫度保存及反復(fù)凍融處理后TransGen產(chǎn)品仍可穩(wěn)定擴增。
? TaqMan探針法
PCR反應(yīng)開始時，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針和引物依次退火到模板上進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發(fā)光基團和淬滅基團分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。
全式金推出的PerfectStart? II Probe qPCR SuperMix UDG利用在PCR體系中加入熒光探針(TaqMan或Molecular Beacon等)，在擴增過程中其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比，最終通過熒光量的檢測測定樣本核酸量。
● 產(chǎn)品特點
? 3種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率高。
? 特殊優(yōu)化的qPCR反應(yīng)緩沖液，可提供更高的靈敏度和特異性。
? 使用UDG酶和dUTP，有效防止PCR產(chǎn)物污染，數(shù)據(jù)準確。
? 配有適用于不同機型的Passive Reference Dye (調(diào)整PCR加樣誤差引起的管間差異)，數(shù)據(jù)準確。
? 適用范圍廣，已成功用于非洲豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、哈維氏弧菌、蝦肝腸胞蟲和副溶血性弧菌等檢測。
? 穩(wěn)定性好，在反復(fù)凍融、預(yù)混液、常溫、37℃等條件下保存，均可穩(wěn)定擴增。
? 提供可凍干版本。
● 多重PCR檢測
以牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) cDNA、豬藍耳病病毒(PRRSV) cDNA、非洲豬瘟病毒(ASFV)質(zhì)粒、偽狂犬病病毒(PRV)gDNA混合物為模板，進行qPCR檢測。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品可進行4重檢測。
● 高靈敏度、高擴增效率
分別以不同濃度豬藍耳病病毒(PRRSV) cDNA(10 pg、0.1 pg、0.01 pg)及不同濃度牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) cDNA（100 pg、1 pg、0.1 pg）為模板，使用TransGen、Company V、Company T產(chǎn)品進行qPCR檢測。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品靈敏度可達0.1 pg，擴增效果優(yōu)于Company V與Company T。
● 適用范圍廣
TranGen產(chǎn)品可成功對不同濃度（107 copies/ml-104 copies/ml，10倍稀釋）的哈維氏弧菌、蝦肝腸胞蟲和副溶血性弧菌DNA進行檢測。
● 穩(wěn)定性好
?批次穩(wěn)定性
使用不同批次的TransGen產(chǎn)品進行單重、四重qPCR檢測。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品可保障穩(wěn)定的批次重復(fù)性。
?凍融穩(wěn)定性
使用5、10、15、20次反復(fù)凍融保存處理后的TransGen產(chǎn)品分別進行單重、四重qPCR檢測。結(jié)果表明，反復(fù)凍融后TransGen產(chǎn)品性能不受影響，仍可穩(wěn)定擴增。
?預(yù)混穩(wěn)定性（單重）
將單重、雙重、三重檢測基因的引物探針與TransGen產(chǎn)品進行預(yù)混，并在不同溫度處理7天后進行qPCR檢測，結(jié)果表明，TransGen預(yù)混液在不同溫度保存后仍可穩(wěn)定擴增。
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