2024 諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎：microRNA 開啟基因調(diào)控新維度
2024 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的頒布，再次吸引了全球科學(xué)界的目光。今年，這一殊榮授予了兩位科學(xué)家：Victor Ambros和Gary Ruvkun，他們因發(fā)現(xiàn)microRNA及其在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用，獲得2024年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
圖1 2024年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲獎?wù)撸琕ictor Ambros和Gary Ruvkun
microRNA 的發(fā)現(xiàn)過程
故事要從 20 世紀(jì) 80 年代末說起，Ambros和Ruvkun一直在研究秀麗隱桿線蟲（現(xiàn)在都已成為模式生物了）的生命進(jìn)程，他們將目標(biāo)鎖定在了兩個突變株 “l(fā)in-4” 和 “l(fā)in-14”上。Ambros驚奇地發(fā)現(xiàn)，lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “負(fù)調(diào)控者”，但其中的抑制機(jī)制卻如同籠罩在一層迷霧之中，讓人捉摸不透。
時光流轉(zhuǎn)，Ambros直到博士后生涯結(jié)束，才在哈佛大學(xué)的實驗室里意外迎來了重大突破。他發(fā)現(xiàn)，lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因，極有可能是 lin-4 產(chǎn)生的一種超短 RNA。與此同時，Ruvkun也有了驚人發(fā)現(xiàn)，他察覺到 lin-4 并不影響 lin-14 基因產(chǎn)生mRNA，而是阻止 mRNA 產(chǎn)生蛋白質(zhì)。并且，他還找到了 lin-14轉(zhuǎn)錄mRNA 上的一個關(guān)鍵位置，這個位置就是 lin-4 對其進(jìn)行抑制的結(jié)合位點。
當(dāng)Ambros和Ruvkun交流彼此的發(fā)現(xiàn)后，一個具有突破性的結(jié)論誕生了：lin-4 中的超短 RNA 與 lin-14 中 mRNA 的關(guān)鍵片段序列互補(bǔ)，正是通過這種奇妙的結(jié)合，超短 RNA 如同一個“開關(guān)”，“關(guān)閉”了 lin-14基因的表達(dá)，阻止它產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)，揭開了以前從未被知曉的、基于 microRNA 的基因調(diào)控機(jī)制。因為在此之前，科學(xué)家們一直認(rèn)為是一種名為 “轉(zhuǎn)錄因子” 的特殊蛋白質(zhì)，通過與 DNA 的特定區(qū)域結(jié)合，來決定產(chǎn)生哪些 mRNA，從而實現(xiàn)基因調(diào)控。
圖2 Ambros和Ruvkun發(fā)現(xiàn)lin-4來源的microRNA過程
限于當(dāng)時的環(huán)境和人們的認(rèn)知，他們的發(fā)現(xiàn)之路并非一帆風(fēng)順。1993 年，當(dāng)Ambros和Ruvkun在《Cell》雜志上發(fā)表這一創(chuàng)新成果時，卻并沒有引起科學(xué)界過多的關(guān)注。盡管這是前所未有的重大發(fā)現(xiàn)，但科學(xué)界卻認(rèn)為這種機(jī)制可能僅僅是秀麗隱桿線蟲的獨特特性，與人類和其他更復(fù)雜的動物毫無關(guān)系。
但命運的轉(zhuǎn)折總是充滿戲劇性，2000 年時，當(dāng)Ruvkun研究小組公布他們發(fā)現(xiàn)的另一種由 let-7 基因編碼的 microRNA 時，曾經(jīng)的沉默瞬間被打破，引起了巨大的轟動。因為與 lin-4 不同，let-7 基因普遍存在于整個動物界。這一驚人發(fā)現(xiàn)如同在科學(xué)界投下了一顆重磅炸彈，引發(fā)了一場激烈的研究熱潮。在接下來的幾年里，數(shù)百種不同的 microRNA 被一一鑒定出來。
圖3 Ruvkun克隆了第二個編碼microRNA的基因let-7，該基因在進(jìn)化中是保守的且普遍存在于整個動物界
如今，人體內(nèi)超過一千種 microRNA 已被發(fā)現(xiàn)?？梢院敛豢鋸埖卣f，沒有它們，細(xì)胞和組織就無法正常發(fā)育，而它們的異常和突變甚至可能引發(fā)癌癥等嚴(yán)重疾病。microRNA 的出現(xiàn)，就像是為生命的基因調(diào)控世界打開了一扇全新的大門，揭示了一個全新的維度，它對所有復(fù)雜的生命形式都至關(guān)重要。
圖4 自1993-2000發(fā)現(xiàn)microRNA開始的microRNA研究進(jìn)程
microRNA 的應(yīng)用
近些年來由于對microRNA研究的比較多，我們知道m(xù)icroRNA 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為 22 個核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子。它通過與靶 mRNA 結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。
圖5 microRNA的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)揭示了基因調(diào)控的一個新維度
醫(yī)學(xué)領(lǐng)域
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，microRNA 展現(xiàn)出了巨大的潛力，可作為疾病的重要生物標(biāo)志物。例如，眾多研究已表明，在某些癌癥中，特定的 microRNA 表達(dá)水平會發(fā)生顯著變化。Lan 等人在權(quán)威期刊《Biomedical Research International》發(fā)表的論文中深入探討并強(qiáng)調(diào)了 microRNA 作為癌癥潛在生物標(biāo)志物的重大意義。以肝癌為例，大量研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的癌癥（肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等）患者中，不同的microRNA的表達(dá)水平有非常明顯的變化。通過對血液中microRNA含量的精準(zhǔn)檢測，能夠為癌癥的早期診斷提供極為重要的參考依據(jù)。
同時，microRNA 為疾病治療開辟了新的策略。Krützfeldt 等人在國際著名期刊《Nature》發(fā)表的研究中，創(chuàng)新性地介紹了 “antagomirs” 這種反義寡核苷酸，它可在體內(nèi)有效地沉默 microRNA。通過使用特定的 microRNA 模擬物或抑制劑，可以精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而為疾病治療帶來新的希望。在一些癌癥的治療研究中，科學(xué)家們積極探索使用 microRNA 抑制劑來抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散。例如，針對某些特定類型的癌癥，研究人員發(fā)現(xiàn)特定的 microRNA 抑制劑能夠靶向作用于腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供了新的思路和方法。
農(nóng)業(yè)領(lǐng)域
在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，microRNA 在植物的生長發(fā)育和抗逆性中起著至關(guān)重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》發(fā)表的文章中，系統(tǒng)地強(qiáng)調(diào)了 microRNA 在作物復(fù)雜性狀改良中的重要意義。通過調(diào)控植物中的 microRNA 表達(dá)，可以有效地改良農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。比如，在面對干旱、鹽堿等不良環(huán)境時，調(diào)節(jié)與植物抗逆性相關(guān)的 microRNA，可以顯著提高農(nóng)作物的耐受性。此外，還可以利用 microRNA 技術(shù)來培育具有特定性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探討了 microRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控在植物基因工程中的潛在應(yīng)用。通過對特定 microRNA 的調(diào)控，可以實現(xiàn)對農(nóng)作物生長發(fā)育過程的精準(zhǔn)干預(yù)，培育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)良性狀的農(nóng)作物品種，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供了新的技術(shù)手段。
研究方法
那么如何研究 microRNA 呢？ 常用的實驗方法和技術(shù)手段也是豐富多樣的，下面跟大家介紹一些常用的實驗研究方法。
① Northern Blot
這是一種經(jīng)典的 RNA 檢測方法。通過電泳將 RNA 分離，然后將其轉(zhuǎn)移到膜上，利用特定的 microRNA 探針進(jìn)行雜交，檢測 microRNA 的表達(dá)水平。雖然該方法相對較為繁瑣，但具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。
圖6 Northern Blot檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性
② 基因芯片技術(shù)
這是一種高通量的檢測方法，可以同時檢測大量 microRNA 的表達(dá)水平。通過將已知的 microRNA 探針固定在芯片上，與樣本中的 microRNA 進(jìn)行雜交，然后利用熒光或其他信號檢測技術(shù)，快速獲取樣本中 microRNA 的表達(dá)譜。這種方法能夠全面地了解不同生理或病理狀態(tài)下 microRNA 的變化情況，為研究 microRNA 的功能提供重要線索。這種方法成本較高；可能存在假陽性和假陰性結(jié)果；對樣本的質(zhì)量和數(shù)量要求較高。
③ 實時定量 PCR（RT-qPCR）
該方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測出微量的 microRNA。通過設(shè)計針對特定 microRNA 的引物和探針，利用 PCR 技術(shù)對 microRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，并實時監(jiān)測擴(kuò)增過程中的熒光信號變化，從而計算出 microRNA 的相對或絕對表達(dá)量。由于其操作相對方便，方法簡單，通量高，已經(jīng)成為實驗室里面常用的一種檢測microRNA的方法了。
這種方法首先要把 RNA 提取出來，microRNA 的 qPCR 的檢測與正常的基因無明顯差異，但由于 microRNA 比較小，所以需要的特殊的反轉(zhuǎn)錄方法。常用的反轉(zhuǎn)錄方法有兩種，一種為莖環(huán)法（Stemloop specific primer），一種為加尾法（Universal primer）。
圖7 microRNA常見的2種反轉(zhuǎn)錄的方式
④ RNA 干擾技術(shù)
這是一種研究 microRNA 功能的有力工具。通過導(dǎo)入特定的小干擾 RNA（siRNA）或 microRNA 抑制劑，可以特異性地抑制目標(biāo) microRNA 的功能。相反，使用 microRNA 模擬物可以增強(qiáng) microRNA 的活性。通過觀察細(xì)胞或生物體在 microRNA 功能改變后的表型變化，可以推斷出 microRNA 的生物學(xué)功能。
⑤ 生物信息學(xué)分析
隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量的 microRNA 序列數(shù)據(jù)。生物信息學(xué)方法可以用于分析這些數(shù)據(jù)，預(yù)測新的 microRNA、識別 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的進(jìn)化和功能保守性。例如，利用序列比對算法，可以在不同物種中尋找保守的 microRNA，從而揭示 microRNA 在進(jìn)化過程中的重要作用。
⑥ 細(xì)胞和動物模型實驗
構(gòu)建細(xì)胞和動物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通過在細(xì)胞系中過表達(dá)或抑制特定的 microRNA，可以觀察細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程的變化。在動物模型中，可以通過基因敲除、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)來研究 microRNA 在體內(nèi)的功能。例如，構(gòu)建 microRNA 敲除小鼠模型，可以研究特定 microRNA 在小鼠發(fā)育、生理和疾病中的作用。
圖8 整體原位microRNA 雜交（Whole-mount miRNA ISH）技術(shù)在生物發(fā)育中的應(yīng)用
⑦ microRNA 活性檢測方法
? 報告基因法：構(gòu)建含有 microRNA 靶序列和報告基因（如熒光素酶基因）的載體，當(dāng) microRNA 與靶序列結(jié)合時，會抑制報告基因的表達(dá)。通過檢測報告基因的活性變化，可以間接反映 microRNA 的活性。其中熒光素酶報告系統(tǒng)由于操作簡單、靈敏度高，已廣泛的應(yīng)用于microRNA的活性及靶標(biāo)檢測。更詳細(xì)的方法可以參看下方的視頻。
復(fù)制下方鏈接，可查看完整視頻
http://whhj.net/technology_video.html
? Western blot 檢測靶蛋白法：microRNA 通過與靶 mRNA 結(jié)合抑制其翻譯，從而降低靶蛋白的表達(dá)水平。通過 Western blot 技術(shù)檢測靶蛋白的表達(dá)量變化，可以推斷 microRNA 的活性。
? RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀法（RIP）：利用抗體特異性地結(jié)合與 microRNA 結(jié)合的 RNA 結(jié)合蛋白，然后通過免疫沉淀分離出與該蛋白結(jié)合的 RNA，包括 microRNA 和其靶 mRNA。通過檢測沉淀下來的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量，可以分析 microRNA 的活性及其與靶 mRNA 的結(jié)合情況。
TransGen 相關(guān)產(chǎn)品
小 RNA 提取試劑盒 (ER601)
產(chǎn)品特點
★ 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
★ 適用于從細(xì)胞、組織、新鮮血液、外泌體中提取 miRNA 和 Total RNA
★ 通過調(diào)整加入水相中無水乙醇的用量，可獲得：
1. RNA 離心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后，將流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再經(jīng) miRNA 離心柱吸附 Small RNA；
2. RNA 離心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)
★ 裂解能力強(qiáng)、提取量高、應(yīng)用范圍廣
數(shù)據(jù)展示
分別用 miRNA 提取產(chǎn)品提取 miRNA，2 個重復(fù)，用 miRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品反轉(zhuǎn)后進(jìn)行 qPCR 檢測
強(qiáng)化 RNA 提取試劑盒 (ET111)
產(chǎn)品特點
與其它總 RNA 提取試劑相比，裂解能力強(qiáng)、速度快，RNA 的提取量與純度更高。
? 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿
? 適用于快速提取多種組織和細(xì)胞中的總 RNA
? 應(yīng)用范圍廣：動物、植物組織、血液和細(xì)菌等樣品。小量樣品 (50-100 mg 組織、5×106 細(xì)胞、200 μL 血液 )。大量樣品 ( ≥1 g 組織或 ≥107 細(xì)胞 )
? 提取速度快：一個小時內(nèi)可完成反應(yīng)
? 操作可視化：溶液呈粉紅色，便于分離水相和有機(jī)相
? 提取純度高：DNA 和蛋白質(zhì)的污染低
? RNA 溶解液：便于 RNA 保存和降低對反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的抑制
數(shù)據(jù)展示
TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
TransScript miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒 (AT351)
產(chǎn)品特點
★ 適用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的樣品反轉(zhuǎn)錄
★ 優(yōu)化的加尾酶和反轉(zhuǎn)錄酶配比及反應(yīng)緩沖液，確保 miRNA 的反轉(zhuǎn)錄效率
★ Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反應(yīng)體系中一步完成
數(shù)據(jù)展示
? 批次間穩(wěn)定性好
使用不同批次產(chǎn)品分別以從人血漿中提取的 miRNA 為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測，根據(jù) Cq 值變化判斷該產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性。
? 反轉(zhuǎn)錄效率高
使用 TransGen 和 Company TA 產(chǎn)品，分別以從人血漿中提取的miRNA 為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測，根據(jù) Cq 值變化分析反轉(zhuǎn)錄效果。
TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix
TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成試劑盒 (AT311)
產(chǎn)品特點
★ 在同一反應(yīng)體系中，同時完成反轉(zhuǎn)錄與基因組 DNA 的去除，操作簡便，降低污染幾率
★ 產(chǎn)物用于 qPCR：反轉(zhuǎn)錄 15 分鐘；產(chǎn)物用于 PCR：反轉(zhuǎn)錄 30 分鐘
★ 反應(yīng)結(jié)束后，同時熱失活 RT/RI 與 gDNA Remover
★ 合成片段 ≤12 kb
數(shù)據(jù)展示
? 反轉(zhuǎn)錄效率高
? 高效基因組去除
使用不同批次產(chǎn)品分別以人 100 ng 總 RNA、人 100 ng 總 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 為模板，進(jìn)行 RT-PCR 檢測，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析模板 DNA 去除效果；qRT-PCR 檢測 18S DNA 表達(dá)量。
PerfectStart? Green qPCR SuperMix
染料法熒光定量預(yù)混試劑（AQ601）
產(chǎn)品特點
★ 3 種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴(kuò)增效率強(qiáng)，適用物種范圍廣
★ 雙陽離子緩沖液，增強(qiáng)特異性，減少引物二聚體形成，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確
★ 配有適用于不同機(jī)型的 Universal Passive Reference Dye ( 調(diào)整 PCR 加樣誤差引起的管間差異 )，校正孔間信號誤差
數(shù)據(jù)展示
? 擴(kuò)增效率高
以梯度稀釋的質(zhì)粒 DNA (10 ng ～ 0.1 pg，10 倍稀釋 ) 為模板進(jìn)行擴(kuò)增得到的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，TransGen 產(chǎn)品擴(kuò)增效率較高，可得到漂亮的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
? 不同物種模板擴(kuò)增
以不同物種的 RNA 反轉(zhuǎn)錄 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 為模板分別使用 TransGen 與 Company T 的產(chǎn)品進(jìn)行擴(kuò)增 (NTC 無擴(kuò)增 )。結(jié)果顯示，TransGen 產(chǎn)品擴(kuò)增效果與 Company T 產(chǎn)品基本一致。
產(chǎn)品信息
精選文獻(xiàn)
? Duan H J, Chu H Q, Cao T M, et al. Investigation of the cell composition and gene expression in the delayed-type hypersensitivity tuberculin skin test[J]. Military Medical Research, 2023. 使用產(chǎn)品TransZol Up (ET111)
? Wang D, Xu C, Yang W, et al. E3 ligase RNF167 and deubiquitinase STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression[J]. Molecular cell, 2022. 使用產(chǎn)品TransZol Up (ET111)
? He X, Yang L, Huang R, et al. Activation of CB2R with AM1241 ameliorates neurodegeneration via the Xist/miR‐133b‐3p/Pitx3 axis[J]. Journal of cellular physiology, 2020. 使用產(chǎn)品EasyPure? miRNA Kit (ER601)
? Huang R, Jia B, Su D, et al. Plant exosomes fused with engineered mesenchymal stem cell‐derived nanovesicles for synergistic therapy of autoimmune skin disorders[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2023. 使用產(chǎn)品TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
? Zhao J, Zeng X, Liu J, et al. Marasmius androsaceus mitigates depression-exacerbated intestinal radiation injuries through reprogramming hippocampal miRNA expression[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023. 使用產(chǎn)品TransScript? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix
? Gong Q, Wang Y, He L, et al. Molecular basis of methyl-salicylate-mediated plant airborne defence[J]. Nature, 2023. 使用產(chǎn)品TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix
? Wan W, Dong H, Lai D H, et al. The Toxoplasma micropore mediates endocytosis for selective nutrient salvage from host cell compartments[J]. Nature communications, 2023. 使用產(chǎn)品TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis
? Bing C, Kangyu J, Jingyi D, et al. LuHypocretin-1/hypocretin receptor 1 regulates neuroplasticity and cognitive function through hippocampal lactate homeostasis in depressed model. Advanced science, 2024. 使用產(chǎn)品PerfectStart? Green qPCR SuperMix
? Zhang B, He P, Lawrence J E G, et al. A human embryonic limb cell atlas resolved in space and time[J]. Nature, 2023. 使用產(chǎn)品PerfectStart? Green qPCR SuperMix
展望
對 microRNA 的未來研究充滿期待。在研究方向上，科學(xué)家們將進(jìn)一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理過程中的作用機(jī)制，以及與其他基因調(diào)控因子的相互關(guān)系。在疾病治療方面，有望開發(fā)出基于 microRNA 的新型藥物，為癌癥等嚴(yán)重疾病的治療帶來新的突破。同時，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，對 microRNA 的檢測和調(diào)控方法也將更加精準(zhǔn)和高效。
涉及到的參考文獻(xiàn)
? Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993;75(5):843-854. doi:10.1016/0092-8674(93)90529-y
? Wightman B, Ha I, Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 1993;75(5):855-862. doi:10.1016/0092-8674(93)90530-4
? Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kurodak MI, Maller B, Hayward DC, Ball EE, Degnan B, Müller P, Spring J, Srinvasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P, Davidson E, Ruvkun G. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 2000;408(6808):86-89. doi:10.1038/35040556
? https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2024/press-release/
? Lan, H., Lu, H., Wang, X., & Jin, H. (2015). MicroRNAs as potential biomarkers in cancer: opportunities and challenges. Biomedical Research International, 2015, 125094.
? Sundarbose, K., Kartha, R. V., & Subramanian, S. (2013). MicroRNAs as biomarkers in cancer. Diagnostics (Basel), 3(1), 84–104.
? Krützfeldt, J., Rajewsky, N., Braich, R., Rajeev, K. G., Tuschl, T., Manoharan, M., & Stoffel, M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature, 438(7068), 685–689.
? Esau, C., Davis, S., Murray, S. F., Yu, X. X., Pandey, S. K., Pear, M.,... & Lollo, B. A. (2006). miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell metabolism, 3(2), 87–98.
? Eva van Rooij. "The art of microRNA research." Circulation Research 108.2 (2011): 219-234. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.110.227496.
? Tang, J., & Chu, C. C. (2017). MicroRNAs in crop improvement: fine-tuners for complex traits. Nature Plants, 3, 17077.
? Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., & Anderson, T. A. (2006). Plant microRNA: a small regulatory molecule with big impact. Developmental Biology, 289(1), 3–16.
? Zhou, M., & Luo, H. (2013). MicroRNA-mediated gene regulation: potential applications for plant genetic engineering. Plant Molecular Biology, 83(1-2), 59–75.
? Zheng, L. L., & Qu, L. H. (2015). Application of microRNA gene resources in the improvement of agronomic traits in rice. Plant Biotechnology Journal, 13(2), 329–336.
? Kim, D. H., Saetrom, P., Snove, O., Jr., & Rossi, J. J. (2008). MicroRNA-directed transcriptional gene silencing in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(42), 16230–16235.
? Wienholds, E., Koudijs, M. J., van Eeden, F. J., Cuppen, E., & Plasterk, R. H. (2003). The microRNA-producing enzyme Dicer1 is essential for zebrafish development. Nature Genetics, 35(3), 217–218.
? Wang, K., Zhang, S., Wu, H., Ma, L., & Wang, P. (2015). MicroRNA biosensors: opportunities and challenges among conventional and emerging detection methods. Biosensors and Bioelectronics, 66, 160–170.
? Fang, X., & Tan, W. (2013). MicroRNA detection using microarrays: challenges and promises. Biosensors and Bioelectronics, 41, 49–55.
