mRNA體外合成質(zhì)控要點(diǎn)
自新冠疫情爆發(fā)以來(lái)，疫苗研發(fā)一直是醫(yī)藥界密切關(guān)注的對(duì)象。到目前為止，被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的疫苗類型主要包括：滅活疫苗、核酸疫苗、載體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和減毒活疫苗。而核酸疫苗中的mRNA疫苗憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，迅速在疫苗研發(fā)領(lǐng)域占據(jù)一席之地。
mRNA疫苗的優(yōu)勢(shì)：
· 導(dǎo)入細(xì)胞后表達(dá)相應(yīng)的抗原蛋白，無(wú)需體外蛋白表達(dá)、純化過(guò)程。
· 刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
· 遞送系統(tǒng)具有類似佐劑的部分特性，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。
· 通過(guò)細(xì)胞正常代謝完成mRNA的降解，安全性更高。
mRNA疫苗在多種傳染?。鞲胁《?、埃博拉病毒和寨卡病毒）的臨床研究中已經(jīng)取得一定的研究進(jìn)展，但依然存在一些問(wèn)題，如mRNA本身具有的潛在免疫原性、遞送系統(tǒng)的穩(wěn)定性、納米劑型安全性及所使用陽(yáng)離子聚合物/脂質(zhì)體安全性等。此外，雖然mRNA疫苗生產(chǎn)規(guī)模相對(duì)簡(jiǎn)單，但通常采用的是較為復(fù)雜的制劑系統(tǒng)，其藥學(xué)研發(fā)和生產(chǎn)控制也更加復(fù)雜，因此從疫苗的有效性、安全性和質(zhì)量可控性考慮，mRNA疫苗的質(zhì)量控制就顯得格外重要。
在2020年公布的《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中，對(duì)mRNA疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做出了明確要求。mRNA的體外合成的生產(chǎn)工藝包括DNA轉(zhuǎn)錄模板制備、mRNA原液制備、制劑中間產(chǎn)物檢測(cè)和成品檢測(cè)。
DNA轉(zhuǎn)錄模板的制備
通常是利用大腸桿菌來(lái)擴(kuò)增目的基因，隨后進(jìn)行質(zhì)粒純化和模板線性化。此階段關(guān)鍵的質(zhì)控項(xiàng)目包括DNA模板濃度/含量、測(cè)序、純度、雜質(zhì)殘留、微生物限度、內(nèi)毒素等。其中，轉(zhuǎn)錄模板中的雜質(zhì)殘留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白殘留等，這些殘留會(huì)顯著影響體外轉(zhuǎn)錄的效率，因此需要對(duì)模板純度進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控。
mRNA原液制備
通常采用轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行mRNA體外轉(zhuǎn)錄、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶處理、mRNA純化等步驟獲得mRNA原液。mRNA修飾（如修飾核苷的加入）、加Poly(A)尾通常在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中進(jìn)行；加帽可在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行，也可作為單獨(dú)的工藝步驟。此階段關(guān)鍵的質(zhì)控項(xiàng)目包括：加帽率、加Poly(A)尾產(chǎn)物長(zhǎng)度、mRNA序列完整性、序列準(zhǔn)確性、純度、mRNA濃度、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（不完整mRNA、截短RNA等）、工藝相關(guān)雜質(zhì)（殘留蛋白、殘留DNA）、無(wú)菌、內(nèi)毒素等。
制劑中間產(chǎn)物檢測(cè)
mRNA的非病毒遞送系統(tǒng)主要包括但不限于基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)（如核酸脂質(zhì)復(fù)合物（lipoplexes）和陽(yáng)離子脂質(zhì)體等）、基于聚合物的載送系統(tǒng)（如polyplexes等）、基于脂質(zhì)和聚合物的載體系統(tǒng)（如lipopolyplexex等）。mRNA包封/裝載的過(guò)程一般系以聚陽(yáng)離子材料或正電荷脂質(zhì)等材料與mRNA復(fù)合后直接成粒，或成粒后再經(jīng)包覆形成核殼形結(jié)構(gòu)的過(guò)程。制劑制備過(guò)程還包括后續(xù)純化步驟，以去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質(zhì)材料和/或包封過(guò)程中引入的有害物質(zhì)。基于mRNA遞送系統(tǒng)制備工藝的實(shí)際情況，對(duì)制劑中間產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，關(guān)鍵的質(zhì)控項(xiàng)目包括納米顆粒大小及分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位、正電荷材料相關(guān)雜質(zhì)、不飽和脂質(zhì)的氧化及相關(guān)降解產(chǎn)物、納米顆粒聚集產(chǎn)生的顆粒物、未組裝的脂質(zhì)分子、陽(yáng)離子物質(zhì)、未包封的mRNA等。
成品檢測(cè)
除了上述檢測(cè)項(xiàng)目之外，mRNA疫苗還應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)或體外生物學(xué)活性檢測(cè)。研發(fā)早期階段建議根據(jù)質(zhì)量研究部分選擇適宜的方法建立體內(nèi)效力質(zhì)控檢測(cè)；必要時(shí)，根據(jù)產(chǎn)品的作用機(jī)理建立細(xì)胞免疫檢測(cè)活性的質(zhì)控檢測(cè)。
mRNA體外合成質(zhì)控要點(diǎn)總結(jié)
疫情當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外許多企業(yè)和機(jī)構(gòu)大量投入研發(fā)，建立mRNA疫苗新型研發(fā)平臺(tái)。作為國(guó)產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商，全式金為這些企業(yè)提供一系列相關(guān)產(chǎn)品，助力mRNA疫苗研發(fā)。
1. TransStart? FastPfu Fly DNA Polymerase (AP231)
一種用于快速PCR的熱啟動(dòng)超高保真DNA聚合酶，該酶擴(kuò)增速度更快 (6 kb/min)，擴(kuò)增效率更高，產(chǎn)量更高，保真性更高，靈敏度更高。
· 保真性是EasyTaq? DNA Polymerase的108倍。
· 擴(kuò)增產(chǎn)物為平端，可直接克隆于pEASY?-Blunt 系列載體中。
· 基因組DNA 片段的擴(kuò)增 (≤ 15 kb)。
· Plasmid DNA片段擴(kuò)增 (≤ 20 kb)。
2. EasyPure? HiPure Plasmid MaxiPrep Kit (EM121)
利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNA，適用于從≤500 ml LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌中高效地提取質(zhì)粒DNA，操作簡(jiǎn)單，提取速度快，DNA純度高。提取的質(zhì)粒DNA適用于酶切、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。
FlyCut? 系列5分鐘快速內(nèi)切酶，配有通用的專利性配方的特殊緩沖液，具有省時(shí)、高效（酶切效率高，無(wú)星號(hào)活性）的特點(diǎn)。
4. Phi29 DNA Polymerase (LP101)
由重組φ29 DNA polymerase 基因的載體，在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化而成, 分子量為74.4 kDa。具有高保真、高效率、高靈敏度、高產(chǎn)量的特點(diǎn)，用于測(cè)序、SNP基因分型、STR/微衛(wèi)星分析、病毒檢測(cè)和miRNA檢測(cè)。
5. MagicPure? Size Selection DNA Beads (EC401)
基于Solid Phase Reverse Immobilization (SPRI) 原理，采用具有獨(dú)特分離作用的磁珠與緩沖液系統(tǒng)，適用于DNA純化、DNA濃縮、高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建中DNA片段分選，使用方法可與主流文庫(kù)構(gòu)建試劑盒兼容。
6. DNA文庫(kù)構(gòu)建（轉(zhuǎn)座酶法/傳統(tǒng)DNA建庫(kù)法）
★TransNGS? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 50 ng/5 ng/1 ng DNA) (KP101/KP121/KP111)
★TransNGS? DNA Library Prep Kit for Illumina? (KP201)
7. RNA文庫(kù)構(gòu)建
★TransNGS? RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina? (KP601)
★TransNGS? Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina? (KP701)
mRNA原液制備
1. T7 High Efficiency Transcription Kit (JT101)
利用T7 RNA Polymerase，以含有T7啟動(dòng)子的超螺旋質(zhì)粒DNA或線性DNA為模板，對(duì)T7啟動(dòng)子下游的DNA序列進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄。適用于制備長(zhǎng)度超過(guò)6000 nt的高濃度RNA，制備的RNA可用于體外翻譯、RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)、RNA剪切以及雜交探針標(biāo)記等。全式金T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄試劑盒在每20 μl體系中，1 μg模板可以生成150-280 μg的RNA。
本產(chǎn)品包含牛痘病毒加帽酶、mRNA帽結(jié)構(gòu)2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和其他加帽反應(yīng)組分，可用于對(duì)T7體外轉(zhuǎn)錄(JT101)產(chǎn)生的RNA進(jìn)行5’加帽修飾，具有高效、高靈活性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。反應(yīng)產(chǎn)物為Cap1-mRNA，加帽效率可接近100%，并且帽子結(jié)構(gòu)方向正確，對(duì)于mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)（出核）、翻譯過(guò)程均有重要作用。
3. mRNA Poly(A) Tailing Kit (LA201)
本產(chǎn)品反應(yīng)時(shí)不依賴模板的存在，催化ATP轉(zhuǎn)化為AMP并依次摻入到RNA的3’末端，即在mRNA的3’末端加Poly(A) 尾，提高RNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。本產(chǎn)品具有很高的加尾效率，且可平行放大體系用于在體外轉(zhuǎn)錄(JT101)及加帽后(LC101) mRNA的加尾修飾，制備可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的RNA樣品。具有高效率、高靈活性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。
4. MagicPure? mRNA Kit (EC511)
偶聯(lián)了Oligo (dT)的磁珠與帶Poly(A)尾的mRNA特異結(jié)合，純化后的mRNA純度高，完整性好，得到的mRNA適用于RT-PCR、qRT-PCR、二代測(cè)序等。本試劑盒適用于磁棒式高通量核酸提取儀。
5. EasyPure? RNA Purification Kit (ER701)
利用硅膠膜離心柱特異地吸附RNA，純化經(jīng)DNase I處理的總RNA產(chǎn)物、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、RNA標(biāo)記產(chǎn)物、合成RNA等，能有效地去除蛋白質(zhì)、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)鹽離子等雜質(zhì)，操作簡(jiǎn)便、快速。
6. MagicPure? RNA Beads (EC501)
利用獨(dú)特的磁珠與緩沖液系統(tǒng)，特異地吸附RNA，純化去除rRNA的RNA產(chǎn)物，經(jīng)DNase I處理的RNA產(chǎn)物，純化體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、RNA標(biāo)記產(chǎn)物和合成RNA等。操作簡(jiǎn)便、快速。
自動(dòng)核酸提取儀
TS-32/96自動(dòng)核酸提取儀是采用先進(jìn)磁珠分離技術(shù)的高科技產(chǎn)品，具有自動(dòng)化程度高，提取速度快，結(jié)果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。全式金作為國(guó)內(nèi)知名的核酸分離純化技術(shù)公司，可提供多種配套提取試劑盒，使儀器的使用范圍最大化，成本低廉化。
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參考文獻(xiàn)
[1] 新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）
